在细菌基因组DNA提取实验中，通过前期的细菌培养与收集，我们已经获得了足够的菌体数量。接下来的关键步骤是细胞裂解，旨在破坏细菌的细胞壁和细胞膜，以释放DNA。我们采用化学与物理相结合的方法，首先使用特定的酶对样品进行处理，这些酶可以特异性降解细菌细胞壁的成分。随后，利用超声波或法式压碎法进一步破坏细胞，以确保DNA能够充分释放。

完成细胞裂解后，面临的挑战是如何有效分离和纯化DNA。我们利用DNA在不同盐浓度和pH下的溶解度差异，通过一系列有机溶剂萃取步骤，有效去除蛋白质和多糖等杂质，同时保护DNA免遭降解。每一步操作必须谨慎，以避免剧烈振荡，以防DNA断裂。

一、试剂盒组成、贮存与稳定性

1. 说明书，耗材包括DNA制备管、小量滤器、2ml离心管和15ml离心管。
2. RNaseA：50mg/ml，室温保存。
3. *：50%甘油溶解*，浓度为50mg/ml，-20℃密闭贮存。
4. BufferS：细菌原生质制备液，添加RNaseA后，4℃密闭贮存。
5. 025MEDTA：室温密闭贮存。
6. BufferG-A：裂解液，室温密闭贮存。
7. BufferG-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。
8. BufferDV-A：BufferDV的制备液，按实验准备的配制方法配制，室温密闭贮存。
9. BufferDV：相分离液，室温密闭贮存。
10. BufferBV：DNA结合液，室温密闭贮存。
11. BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。
12. BufferW2浓缩液：去盐液。使用前按照试剂瓶上的比例加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可以使用100%乙醇或95%乙醇。
13. Eluent：25mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。

二、实验准备

1. 每次使用时，在BufferW2中按照试剂瓶上的比例加入无水乙醇并混合均匀。
2. 准备BufferDV：取2ml BufferDV-A，125ml异丙醇，75ml，加入提供的250ml试剂瓶中，混合均匀。
3. 将BufferDV预冷至4℃。
4. 每次使用试剂盒时，用50%甘油溶解*，使*浓度为50mg/ml。
5. 每次使用试剂盒时，将随试剂盒携带的RNaseA全加入BufferS中，混合均匀。
6. 准备65℃水浴。
7. 检查BufferG-A和BufferG-B是否出现沉淀，如有，则需在65℃水浴中加热至沉淀溶解后再使用。
8. 将Eluent或去离子水加热至65℃以利于基因组DNA的充分洗脱。

三、操作步骤

1. 用2ml离心管收集10×10⁹（1ml菌液OD600为1-15）的细菌培养物，12000×g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入RNaseA的BufferS悬浮沉淀。确认RNaseA已加入BufferS中，悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则将影响溶菌效果。
2. 加入20μl*贮存液，混合均匀，室温静置5min。
3. 加入30μl 025MEDTA（pH 8.0），混合均匀，冰浴5min。
4. 加入450μl BufferG-A，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
5. 加入400μl BufferG-B和1ml BufferDV（4℃预冷），充分混合，12000×g离心2min。请在实验前准备BufferDV。
6. 尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷BufferDV，充分混合，12000×g离心2min。
7. 丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2ml离心管中），12000×g离心1min。无须完全丢弃上相，在转移无色下相时偶有混入的上相可在Tip头内迅速分相，便于丢弃。
8. 弃滤器，在滤液中加入400μl BufferBV，混合均匀。步骤9-12可选择离心法或负压法：

A. 负压法

9A. 将制备管插入负压装置的插口，将步骤8中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20至-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。
10A. 保持负压，加入500μl BufferW1，吸尽管中溶液。
11A. 保持负压，沿管壁四周加入700μl BufferW2，吸尽管中溶液；同样方法再用700μl BufferW2洗涤一次。
12A. 将制备管置于一个2ml离心管中，12000×g离心1min。

B. 离心法

9B. 将制备管放入2ml离心管中，移入步骤8中的混合液，12000×g离心1min。
10B. 弃滤液，将制备管放回原2ml离心管中，加入500μl BufferW1，12000×g离心1min。
11B. 弃滤液，将制备管重新放回原2ml离心管中，加入700μl BufferW2，12000×g离心1min。再用700μl BufferW2清洗一次。
12B. 弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12000×g离心1min。
13. 将制备管转移至另一洁净的15ml离心管，在silica膜上加100-200μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min以洗脱DNA。

通过乙醇沉淀法，将提纯的DNA从溶液中析出。该过程在低温下进行，以帮助DNA的凝聚和沉淀。在离心收集沉淀后，用70%乙醇洗涤数次，彻底去除残留的盐类和有机溶剂，这一步骤对保证DNA的纯度至关重要。

最后，将洗涤后的DNA沉淀晾干，溶解在适量的TE缓冲液中，即得到了较为纯净的细菌基因组DNA溶液。通过电泳检测，可以直观观察到DNA条带的清晰度和完整性，从而评估提取效果。至此，整个细菌基因组DNA提取实验顺利结束，为后续的生物医学研究打下了坚实的基础。这一过程中，尊龙凯时始终致力于提供高质量的科研产品和技术支持，助力科学研究突破新的边界。